ELISA實驗常見問題及解決方法

　　標準曲線不佳

可能原因 解決方法

倍比稀釋標準品時未混勻 稀釋標準品的每一步均需混勻

過早稀釋 標準品在快要使用時稀釋

加入的體積不正確 使用校準過的移液器，快速、等量的將標準品分配到各個微孔中

　　高背景或陰性對照值偏高

可能原因 解決方法

陰性對照孔被陽性對照或樣品污染 洗滌時，勿將洗液溢出孔外

抗體非特異性結(jié)合 封閉液不適合，更換封閉液

酶結(jié)合物過濃 請檢查酶結(jié)合物是否按說明書規(guī)定稀釋

孵育溫度過高 檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定

底物在使用前曝光 應(yīng)保存在暗處，避光

讀板前停留時間過長 加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù)

　　陽性對照值偏低或低吸光度

可能原因 解決方法

試劑未平衡至室溫 實驗開始前，將試劑盒從冰箱取出平衡至室溫

檢測體積偏小 檢查移液器吸液管道是否堵塞

孵育時間過短 使用計時器，準確孵育時間

底物受污染 使用新配置的試劑，重新實驗

包裝袋中有濕氣 檢查袋中是否有干燥劑

樣本中有抑制劑 疊氮鈉會抑制HRP酶的活性

　　邊緣效應(yīng)

可能原因 解決方法

蒸發(fā) 各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板

溫度不均勻 校準孵育箱，勿疊放反應(yīng)板

標準曲標準曲線良好，但樣本無檢測信號

可能原因 解決方法

樣本中無檢測物或檢測物含量極低 設(shè)置內(nèi)參，重新實驗

樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測 作適當(dāng)稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測回收率

樣本中檢測物濃度過高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值 適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本，檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi)

　　重復(fù)性較差

可能原因 解決方法

微孔中有氣泡 用針尖挑破氣泡

試劑未混勻 確保充分混勻試劑

樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 使用前離心

微孔包被面被吸頭劃破 加液時小心操作

使用用過的封板膠紙 每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔

　　假陽性反應(yīng)

可能原因 解決方法

洗滌不充分 使用前需檢查洗板機是否正常工作

洗板機管道堵塞 需經(jīng)常維護洗板機

加結(jié)合物時，灑在微孔邊緣 小心向微孔加入結(jié)合物，加入微孔底部中央，避免與孔壁和邊緣接觸

檢測樣本中含有紅細胞 離心

微孔中液體揮發(fā) 用封板膠密封反應(yīng)孔，置于濕盒內(nèi)

整塊板產(chǎn)生陽性O(shè)D值或整個板顯藍色

可能原因 解決方法

洗滌液體積不足或底物被殘留于孔底的結(jié)合物所污染 洗滌時，緩沖液充滿至孔邊緣，但要確保不能溢出孔外

結(jié)合物濃度過高 檢查是否按照說明書推薦比例稀釋

血清中有血清因子 勿加熱血清

底物容器不潔凈 用酸清洗容器瓶，用蒸餾水沖洗

底物孵育時，微孔板曝光 加底物時，立即將板置于暗處

　　整塊板OD值偏低

可能原因 解決方法

顯色時間不足 適當(dāng)延長顯色時間

孵育溫度偏低 36度為最適反應(yīng)溫度

未加終止液 加入終止液，增強顏色反應(yīng)的強度，穩(wěn)定最終的顏色反應(yīng)

顯色緩慢

可能原因 解決方法

樣本未置于室溫 實驗開始前，將樣本平衡至室溫

酶結(jié)合物活性減弱 檢測稀釋度

酶活性收到抑制如疊氮鈉 避免實驗不當(dāng)?shù)姆栏瘎?br />
顯色溫度不適當(dāng) 按說明書操作

注：以上資料僅供參考，具體產(chǎn)品請咨詢技術(shù)老師或是品牌供應(yīng)商。

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